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WB常见问题(七)-5个WB遇信号微弱该做的事

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WB常见问题(七)-5个WB遇信号微弱该做的事

5571 人阅读发布时间：2020-05-19 14:37

新闻图片1

人生不该留白, 留白的蛋白质免疫印迹 (Western Blot,WB)，让人脑袋一片空白，头发也发白。这最难的一课怎解? GeneTex不藏私，分析WB实验无条带或弱条带的原因及解决方法，让您的实验在图片上留下印迹，发表成果在科研里留下足迹。

解决方案：

a.目标蛋白是否有细胞器特异性? 可提取特定细胞器增加蛋白浓度，例：抽取核蛋白、膜蛋白、质蛋白。

b.目标蛋白是否有组织特异性? 有些目标蛋白只会在特定的组织表达，这可降低样本挑选的错误率。

c.目标蛋白是否有后修饰作用? 目标蛋白后修饰使分子量变大或产生剪切体使分子量变小，使预测的位置没有信号。

d.确认目标蛋白在细胞株的表达量以及是否需加药活化蛋白表达。

e.文献较少的目标蛋白，可参考其mRNA的表达量，寻找mRNA表达量较高的细胞株进行实验，不过须注意mRNA和蛋白的表达量不一定是正比关系，或许可以挑选组织样本和细胞株一起比较。

a.确认目标蛋白在细胞株的表达量以及是否需加药活化蛋白表达。

b.文献较少的目标蛋白，可参考其mRNA的表达量，寻找mRNA表达量较高的细胞株进行实验，不过须注意mRNA和蛋白的表达量不一定是正比关系，或许可以挑选组织样本和细胞株一起比较。

参考抗体厂商提供的产品信息，例如：抗体测过的样本当作阳性对照，可作为操作问题或是蛋白不表达的依据。

一般蛋白上样量为20-30μg/孔，如文献已表明目标蛋白表达量低或是使用极少的上样量(例如< 10μg)，需增加上样量来协助抗体侦测其信号。

蛋白质降解可使条带变弱(如下图)

新闻图片8

甚至无法重复之前的结果，为避免这个情况的发生，可使用以下的方法来避免：

a.细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解。

b.在冰上操作蛋白质实验。

c.避免反复冻融样品(建议分装)。

d.直接新鲜制备新一批的样本。

信号弱或白片可能是抗体孵育条件、一二抗配对、或是过度洗脱等问题造成。

解决方案：

a.增加抗体量，例如原本使用1:1000稀释，调整为1:500稀释。

b.增加孵育时间：将原37度孵育1小时改成4度孵育过夜。

c.确认抗体有没有异常，例如: 重复使用太多次，失去活性；NaN3加到二抗缓冲液里会降低底物灵敏度。

检查二抗与一抗种属是否有正确配对，要诀: ”鼠配鼠兔配兔，isotype相配不出错”。

降低清洗次数与时间：一般清洗三次，每次5-10分钟即可。

转膜不完全，蛋白在膜上的量会减少，也会导致信号微弱

解决方案：

如果转膜方向错误会让蛋白往反方向移动进而散逸在transfer buffer里，方向正确才能让蛋白黏附在transfer membrane的孔洞。

如果使用PVDF膜，需先浸MeOH使膜活化才能使用。

a.大蛋白: 转膜条件可调整为低温过夜(湿式transfer)。

b.小蛋白: 可更改使用 0.2 μm 的transfer membrane，并缩短转膜时间。

转膜后，需使用丽春红(Ponceau S)等染剂染膜确认转膜效率，如下图:

新闻图片18

过度封闭或封闭液与抗体作用可能导致白片。

解决方案：

a.降低封闭液浓度: 一般使用3-5%的脱脂乳或BSA做封闭液即可

b.降低封闭时间: 一般封闭时间为30-60分钟

c.抗体如跟封闭液交互作用，也可能因抗体被中和而造成白片, 此时可换封闭液解决，例如使用commercial Blocking Reagent (GTX30963)可协助避免这个问题的发生

化学发光底物失活，也可能导致条带变弱。

解决方案：

a.使用现配的化学发光底物，避免失活。

b.使用高敏感度的化学发光底物，例如使用 femtogram (GTX14698)等级的化学发光底物。

c.延长压片时间。

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