推荐产品
公司新闻/正文
2个ICC/IF染色位置错误该做的事
2353 人阅读发布时间：2021-06-02 08:13
相对的，免疫组织化学（IHC）样品为组织，可使用荧光或化学方式呈色。细胞免疫染色步骤如上图，
需将细胞固定在盖玻片上经过通透、一二抗染色等步骤, 最后成像拍照。
当ICC染色定位不正确怎么办呢?莫急莫荒莫害怕 1. 可检查细胞爬片 2. 检查固定与通透。
重点1: 细胞黏附好，型态才会好
a.盖玻片处理: 通常细胞在盖玻片上黏附能力都不强，可以使用几种成分铺在盖玻片上，
以增强细胞与玻璃盖玻片的黏附，常用的溶液成分如下表，不同的细胞需进行个别的调整，以得到最佳的结果。
一般使用分盘后培养隔夜(时间太短细胞贴附不完全，太长细胞会太老不健康)，细胞密度约50-70 %的爬片，
密度太高或太低都可能对靶标蛋白的定位产生负面的影响，需要根据靶标特性调整适宜的细胞类型与密度，
例如在研究细胞连接标记蛋白时，维持细胞与细胞间的接触就特别重要，
选择较容易观察到细胞连接的细胞种类，最佳细胞密度也要有80%以上。
N-Cadherin antibody (GTX112734)
c.细胞培养条件: 有些靶标蛋白的表达和定位，随着细胞周期或细胞应激反应而变化，
须确保用来制作爬片的细胞状态为观察靶标蛋白的最佳条件，例如观察细胞分裂相关蛋白，
可将细胞做同步处理，使细胞处于同一个细胞周期阶段，否则就需要在细胞爬片中仔细观察靶标蛋白的信号，
又如观察自噬反应中的LC3B蛋白，如未加入诱发细胞展开自噬的药物，将较难观察到正确的定位结果。
Aurora B antibody (GTX132702)
重点2: 悬浮细胞染色有诀窍
a.分盘时，将细胞悬浮溶液接种于涂层处理过的盖玻片上，接着即可比照黏附型细胞的实验步骤。
RIP3 antibody (GTX131188)
b.在细胞悬浮溶液中进行完固定步骤，利用细胞离心技术(CytospinTM)将细胞低速离心至涂层处理过的盖玻片上，
也可以用移液管吸取细胞悬浮液滴于已涂层的盖玻片上。
c.在悬浮状态中进行完所有染色步骤，最后用移液管移至器皿或载玻片上进行显微镜成像。
d.小星狮小技巧: 可以将固定后的悬浮细胞溶液与2-3 % 的琼脂等比例混合，将细胞检体包覆，
待琼脂胶体凝固后，再按照常规的脱水、包埋程序做石蜡包埋，制作成的细胞蜡块，之后再进行组织切片，
此玻片样本可照一般石蜡组织切片IHC的操作方法进行免疫化学染色，与一般ICC最大的不同为:
此组织蜡块制作的玻片需烤过，再进行脱蜡与回水，也需要进行抗原修复的步骤，基本上是当作IHC进行实验，
对于较难得到的细胞样本(如病毒感染的细胞)，可用此方法保存细胞蜡块，日后若有需要只要进行切片即有样本。
Tristetraprolin antibody (GTX130974)
Dengue virus NS1 protein antibody (GTX124280)
样品的固定与通透对实验结果影响很大，最适合的固定与通透方法，与细胞类型、靶标蛋白和使用的抗体有关，
尝试不同的固定和通透条件，将有助于得到靶标蛋白在抗体染色的最佳信号与正确定位。
a.固定剂的选择: 固定剂主要有两大类，交联剂(如多聚甲醛)与有机溶剂(如甲醇或丙酮)，
交联剂通过疏水性交联把蛋白与蛋白连起来，有机溶剂能使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上，
也具有细胞通透的性能，多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定剂，建议最初从4% PFA，
固定15分钟开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂，
GeneTex在固定剂的使用经验整理如下表，但仍须根据靶标蛋白或抗体的不同逐步调整出最佳方案。
mTOR antibody [C3], C-term (GTX101557)
MUL1 antibody (GTX112673)
LAMP3 antibody (GTX112715)
b.通透條件的選擇: 由於抗體無法直接穿過數十微米的細胞質膜進入細胞，因此，檢測胞內的靶標蛋白時，
需進行通透化處理，利用除垢劑在細胞膜形成孔洞，使得抗體得以進入細胞內，
常用的除垢劑有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等，建議從0.1 % Triton® X-100，
通透5分鐘開始嘗試，倘若沒有達到預期效果，再調整通透時間或通透劑濃度，也可以考慮更換另一種通透劑，
有機溶劑固定劑會引發細胞變性脫水，因此也會破壞細胞膜的完整性，較不適合細胞膜靶標蛋白染色，
一般來說，有機溶劑固定之後也不建議進行細胞通透的步驟，
最佳的細胞通透方法，一樣需要根據靶標蛋白與所使用的抗體而調整，無法用一種方法套用到所有的實驗。
CD45 antibody (GTX116018)
TDP43 antibody (GTX114210)
