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WB常见问题(一)-3个WB遇黑点该做的事

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WB常见问题(一)-3个WB遇黑点该做的事

13880 人阅读发布时间：2020-04-01 16:04

Western Blot遇到黑点，莫急莫慌莫害怕，只要掌握3个关键问题，就能完美呈现漂亮Western Blot！

解决方案：

a.确认奶粉完全溶解：

出现黑点最常发生的原因是奶粉没有完全溶解，建议加入搅拌子，增加搅拌时间，或是溶解后离心取上清液使用。

b.过滤溶液：

可使用0.45um过滤头过滤BSA或是用滤纸过滤奶粉颗粒或其他杂质。

c.改变缓冲液：

脱脂牛奶价钱便宜，如效果不好可换为成分单一的BSA或Casein。

解决方案：

使用新鲜配制的溶液 (Running/transfer/blocking/wash buffers)：使用现配或商品化的溶液减少因长菌长霉造成的黑点。

解决方案：

一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合，因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点或高背景值状况。

1.TBST是以Tris为基底，PBST是以磷酸盐为基底的缓冲液，一般可以根据习惯选择TBST或PBST使用，如果是操作磷酸化抗体或是最终显色分析是用alkaline phosphatase (AP)系统时，因为PBST中的磷酸根会干扰，可能造成高背景值或无讯号，建议使用TBST缓冲液，另外，一次的实验中请用一种缓冲系统，不可blocking buffer用PBST，wash buffer用TBST。

2.封闭时一般使用3-5%封闭溶液，依实验特性不同，可做微调；牛奶与BSA的选择也是相同，掌握原则后，再依实验特性做微调，就能快速上手。

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