WB常见问题(三)-3个WB遇拖带该做的事
10406 人阅读发布时间：2020-04-01 15:15
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| 爱情忌讳拖拖拉拉, 拖拉的条带也让人心里不快, 怎样可以给个痛快呢?用下面的方式即可解决。 |
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| 泳道的条带之间出现像下雨一样的条纹, 原因是样品有盐类、蛋白、核酸或杂质的干扰，导致电泳过程中的电场改变。 |
| 解决方案： |
| a.重新离心样品后取上清液使用 |
| b.使用较纯的试剂配置细胞裂解液或购买商业化产品 |
| c.使用Benzonase®核酸酶： Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰 |
| d.全细胞或亚细胞萃取：使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题 |
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| 解决方案： |
| a.降低蛋白上样量：通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。 |
| b.蛋白变性不完全, 也会使条带成团拖曳；此时，可通过将样品延长加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例, 使蛋白变性更完全。 |
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| 解决方案： |
| a.缩短曝光时间： |
| 过曝时可缩短曝光时间, 减少过曝的情形。 |
| b.使用低灵敏的ECL： |
| 过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。 |
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| ▲化学发光底物一般有三种等级, femto(飞克, 10-15g), pico（皮克, 10-12g）, 及plus(低皮克级, 10-12~ 10-9g) ，可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。 |
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| 另外，制备完下层胶后未用水或醇类覆盖胶体，当样品跑到堆栈层和分离层接口时，蛋白质发生沉淀，之后又随着跑胶过程慢慢溶解，也会形成垂直的条纹，此时只要在加入下层胶体前，用水或醇类覆盖压平就可以有好的结果。 |
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| 还有另一个与拖带现象类似的宽带。宽带其特征是条带较粗, 不紧实, 但没有雨状的拖尾，常出现在小分子量，建议用Tris-Tricine缓冲液系统取代Tris-Glycine系统。 |
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| ▲使用不同成分的胶体进行实验: 一般常用Tris-Glycine系统，另可根据需求或分子量大小调整，例如分子量<15 kDa，建议可用Tris-Tricine。 |
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| 常用跑胶缓冲液系统： |
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| ▲如已使用建议的缓冲液与跑胶百分比, 仍觉得条带太粗, 也可适时调整跑胶浓度。 |
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| ▲胶体百分比与位置 |
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| ▲已有目标条带, 但觉得条带不够紧实, 可微调跑胶百分比。 |
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