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公司新闻/正文

WB常见问题(六)-6个WB遇非专一性该做的事

4348 人阅读发布时间：2020-04-01 15:14

 新闻图片1
 
 1条2条3条， 到底哪一条是我的目标蛋白？非专一性条带看似复杂, 但只要使用注意2方向6小点, 就能找出问题, 快速解决。
 
新闻图片2
 新闻图片3
WB的结果如果目标蛋白条带下有许多条带，像下图, 有可能是蛋白降解造成的。
 新闻图片4
 解决方案：
a.细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂避免蛋白降解。
b.在冰上操作蛋白质实验。
c.避免重复冷冻解冻样品(建议分装)；建议使用新鲜制备的样本。
 
新闻图片5
如WB出现多个条带且与目标蛋白分子量呈倍数增长，有可能是蛋白形成多聚体。
 新闻图片6
 解决方案：
a.如果多聚体是以双硫键键结而成，可使用现配的 DTT / 2-ME并将加热时间延长，这可帮助打断多聚体的双硫键。
b.建议一并确认煮样本的温度是否足够，若煮样本的仪器是电子显示其加热温度，建议可以增加温度计辅助确认温度确实有达到95-100℃。
 
新闻图片7
WB如果出现多条带且没有特定规则, 可进一步查询文献确认蛋白质是否有后修饰、剪切体等。
 解决方案：
a.HIF1 alpha其蛋白的预测分子量是93 kDa，不过由于蛋白后修饰作用的原因，观察到的分子量会在120-130 kDa，也可能会因为不同样本的后修饰作用程度不同，而出现更高的位置。一般判断后修饰分子量的方式会和对照组做比较，其多出来的条带很有可能都是目标蛋白。
 新闻图片8
▲GTX127309使用加药处理可看到HIF1 alpha表达量增加, 使用基因静默也可看到信号减弱，证明此抗体辨识的为HIF1 alpha。
 
b.Caspase 3其蛋白会有剪切体，如果抗体的抗原位置是设计在剪切后的位置，且抗体特性并非只会认别剪切后的蛋白，此时就有可能会同时出现未剪切及剪切的多条带，这些并条带并不是非专一性条带；甚至, 有时这些条带的多寡也会和细胞培养条件有些相关。
 新闻图片9
▲在cisplatin处理下, caspase 3出现未剪切及剪切体的多条带。
 
新闻图片10
新闻图片11
WB结果如果发现泳道和泳道间的缝隙不见了(左图)或出现一团黑(右图)的结果，有可能是蛋白样品过量或一抗浓度太高造成。
 新闻图片12
 解决方案：
a.一般蛋白上样量为30-50μg，如果仍出现此情形，建议可减少上样量。
b.调整增加抗体的稀释倍率，也可调整孵育时间，并使用4℃孵育的孵育温度。
 
新闻图片13
解决方案：
a.洗涤条件：增加洗膜次数与时间或在洗涤液里改用不同强度的detergent或是增加浓度。
b.设对照组来确认抗体非专一性结合可能的原因，例如：实验用的细胞样本里是否有高度表达其内生性目标蛋白表现量。
c.可询问抗体公司是否有任何数据支持其结果。
 
新闻图片14
 解决方案：
这种情况通常发生在IP实验里，GeneTex有一系列可避免辨认heavy/light chain的特制二抗，其设计原理是用来辨认native的一抗结构。
 新闻图片15
▲EasyBlot二抗与native form的一抗有较好的专一性，可减少辨识膜上的denature form 一抗。
 
 

 

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