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WB常见问题(五)-4个WB遇高背景值该做的事

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WB常见问题(五)-4个WB遇高背景值该做的事

20619 人阅读发布时间：2020-04-01 15:14

Western Blot遇到高背景, 就像深山云雾, 有那么一点朦胧美, 却又想扒开云雾,一窥究竟。遇到高背景，只要掌握4个关键，即可烟消云散条带出。

蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。

解决方案：

a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。

b.封闭液是否会与抗体反应：这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中，由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白，因此如果使用牛奶当封闭液，可能会产生封闭液与磷酸化抗体有非特异性的结合。这个情况下，建议使用BSA作为封闭液，同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。

c.封闭时间不够：增加封闭时间也可以降低高背景值的结果，一般情况会使用室温37度封闭1小时，可视情况调整封闭的条件。

在WB实验时，较常见的transfer membrane是NC膜和PVDF膜；可依据蛋白特性、实验室经费，选择适合自己实验条件的材料。提供NC膜和PVDF膜的比较表：

解决方案：

a.没选到适合的膜 : 依据目标蛋白、想要呈现的实验结果及膜的特性，选择出适合实验的材料, 可参考上表。

b.膜干掉：这也会影响实验结果，产生高背景，建议整个实验过程都须注意让膜保持湿润，特别是PVDF膜。

c.膜没有完全均匀湿透：PVDF膜较会出现这个状况，使用PVDF膜前，需用100% methanol完全浸润膜。

解决方案：

a.封闭液及抗体交互作用：如同上述提到的，建议更换封闭液。

b.抗体浓度太高：建议降低抗体浓度，并增加洗涤次数和时间。

c.一抗孵育的温度：若偏高，抗体容易乱黏造成高背景值，建议4℃孵育过夜。

d.二抗的非特异性背景：可增加二抗对照，验证背景是否由二抗所致。

e.洗脱不足：容易造成高背景值，建议增加洗脱液体积和洗涤次数。

解决方案：

ECL呈色问题造成高背景值的原因，可能是因为化学显色底物过多；建议按说明书加入适量的显色底物。

化學發光受質靈敏度：化學發光受質一般有三種等級，femto(10⁻¹⁵g), pico（10⁻¹²g）, 及plus( 10⁻¹²~ 10⁻⁹g) ，可依蛋白表達量挑選適合的化學發光受質。

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