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IHC问题排除(一)-6个IHC型态不佳该做的事

人阅读发布时间：2020-02-14 16:00

解决方案：

a.使用新鲜配制、适当带电(如: Poly-L-lysine)或疏水(如: Silane)处理过的载玻片(处理方式不同对组织的贴附效果也不同)。

b.石蜡切片贴于载玻片后，于60°C烘烤3-5小时最为合适，烘烤不足容易掉片。

c.过程中轻柔冲洗载玻片上的组织。

解决方案：

a.切片刀钝或是刀刃上有缺口：使用锋利刀片重新制备切片。

b.刀刃上有蜡屑的积留：随时将废屑残渣用毛刷清除干净。

c.刀没夹紧或刀的角度倾斜：适当调节切片刀的角度，并确认刀片和蜡块都有夹紧。

d.移动刀座，如果划痕还是出现在相同位置，应该是组织标本内有污物或硬物的问题。

e.确认组织无过度脱水，并调节适当切片速度。

f.在分析实验结果时，避免损坏切片区域。

g.避免展片时于载玻片上形成的气泡。

解决方案：

a.制备较薄的切片：一般来说，冰冻切片的片子较厚(约10-30 um)，一般设定刀片温度为-10~-20度，如设定太冷，可能会切不好；石蜡切片的片子较薄(约5-10 um)。

b.确认已使用适当厚度的盖玻片(通常，生物物镜设计的盖玻璃厚度为0.17 mm)，如使用油镜一定要滴油。

c.建议使用激光共聚焦显微镜成像，去除非焦点平面的噪质。

解决方案：

a.如使用4 % PFA，一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用，可依据染色结果增加固定时间与/或加入后固定的步骤，注意：如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序，一定要将组织置换到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。

b.增加固定液/组织比例，建议固定液体积至少要是组织块的20倍体积。

c.准备较小的组织块(约3-4 mm)，以迸行更完全的浸润固定。

解决方案：

a.凭经验决定保留组织型态的条件，同时恢复抗原的免疫反应性：理论上温度越高，酸碱值越碱，但可能造成较高的背景值或组织型态破坏，因此，建议从92°C, pH6开始尝试，pH6的抗原修复液即适用于大多数抗体。

b.使用冰冻切片样本：冰冻切片一般不做抗原修复，因为抗原修复方式对冰冻切片可能太过强烈，也不需脱蜡、覆水等步骤，能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性。

解决方案：

a.防止组织中冰晶形成：
-速冻使组织温度骤降, 减少冰晶的形成。
-固定后将组织置于20％～30％蔗糖溶液1～3天, 利用高渗吸收组织中水分, 减少组织含水量, 可防止或减少冰晶的形成。

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