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IHC问题排除(二)-6个IHC高背景值该做的事

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IHC问题排除(二)-6个IHC高背景值该做的事

2324 人阅读发布时间：2020-02-14 17:25

新闻图片1

解决方案：

a.尝试用非醛类替代醛类：Glutaldehyde自发荧光强，较常被用来做以电子显微镜显像的组织样品固定，组织荧光染色不建议使用。

b.用淬灭自发荧光的染料或方法处理组织样品：如短波长的UV照射、苏丹黑等。

c.将石蜡包埋样品的方法换成制作冰冻切片，减少固定液的影响。

d.选择一个不会与自发荧光竞争的荧光染料：福尔马林、PFA或Glutaldehyde等会产生高背景的荧光，尤其在使用绿色、蓝色和红色波长光谱范围时；组织中的红细胞或胶原蛋白等组分会产生很强的自发荧光，尤其是使用绿色和红色通道的荧光检测时。

e.组织冲洗不彻底，有固定液残留。

f.使用福尔马林或PFA固定过久：一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用，注意: 如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序，一定要将组织置换到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否则有可能造成蛋白交联无法修复。

g.配置新鲜的固定液。

解决方案：

a.增加封闭液浓度、延长封闭时间。

b.更换封闭液成分，注意: 封闭液成分不可与一抗物种同来源，最好与二抗物种同源，如二抗来自马血清，使用马血清可得到较干净的背景。

新闻图片4

c.底物过量：缩短底物孵育时间。

d.信号过度放大：缩短信号放大试剂孵育时间。

e.洗脱液不适合：如果原本是用PBS，可更换使用TBS。

解决方案：

a.降低抗体浓度，如1：100调整为1：1000。

新闻图片6

b.缩短抗体孵育时间，并在4°c 孵育切片。

c.二抗交叉反应：做多个目标蛋白染色时, 使用预吸附二抗减少与其他物种一抗的交互作用。(预吸附抗体在制造过程中增加过滤程序, 因此不与其他物种一抗结合)。

d.二抗与组织发生非特异性结合：每次实验都要设置一组不加一抗，只加二抗的对照组，才能确认信号是来自高背景值还是真实信号。

新闻图片7

e.非特异性蛋白与抗体结合: 选择通过严格验证策略验证的GeneTex一抗。

新闻图片8

解决方案：

a.使用酶抑制剂。

- 过氧化物酶：使用 H₂O₂ (0.3% v/v)

- 碱性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM)

新闻图片10

解决方案：

a.与 Avidin 孵育以封闭生物素。

解決方案：

a.脱蜡不完全：可能导致细胞核染色在呈相时模糊，亦可能导致抗体无法辨认抗原或者高背景值。

新闻图片13

b.抗原修复方式不适合：更换修复溶液成分或方法。

新闻图片14

c.一抗与组织物种同源：较常发生在使用鼠源抗体染鼠源组织时，除了避开同样物种来源的一抗和组织之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色试剂盒 (GTX83396) 迸行实验。

新闻图片15

d.任何时候都不要让组织干掉。

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