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IHC问题排除(三)-4个IHC讯号微弱该做的事

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IHC问题排除(三)-4个IHC讯号微弱该做的事

1122 人阅读发布时间：2020-02-14 17:39

解决方案：

a.一抗二抗未匹配：使用针对一抗物种来源的二抗 (如一抗来自兔子，则须使用抗兔子的二抗。

b.使用的抗体可能不适合用来做IHC：在非変性 WB 上测试抗体, 以确保抗体识别非变性抗原，或是选用通过IHC实验验证的抗体。

c.没有添加足够的抗体：增加抗体浓度，加长孵育时间，一般建议在4°C过夜孵育。

d.抗体失活：避免将标记荧光基团的二抗放置于光照环境。

解决方案：

a.显色溶液失去作用：通过将二抗标记酶, 取一滴与底物溶液反应, 可确认显色溶液是否失去活性。

b.错误的激发波长：确保激发波长与使用的荧光基团相匹配。

解决方案：

a.脱蜡作用不足：加长脱蜡时间。

b.固定液（福尔马林或 PFA) 可能改变表位：利用抗原修复方式使表位暴露出来或缩短固定作用的时间。

c.固定作用不适当：避免延迟固定或过度固定，一般建议至少固定6小时以上，18~24小时已可满足大多数实验应用。

d.冰冻切片样品保存期过长：冰冻切片制备完成后，最好于1-2个月内用完，超过6个月的话，建议制备新的玻片。

e.荧光染色样品保存不当：荧光基团在光线下暴露时间过长，可能会导致信号衰减，除了在避光环境下进行实验和保存样品，也可使用防荧光淬灭的溶液封固样本，如GTX30920与GTX30921 FluoroShield Mounting Medium，是封片剂也具有复染功能，在做复染的时候，连片子都封固好了，下图皆为使用GTX30920封固的玻片影像。

解决方案：

a.靶蛋白含量低：设置表达量高的组织作为阳性対照组，或利用扩增步骤来放大信号。

b.靶蛋白为核蛋白：在封闭溶液与抗体稀释液中加入细胞破膜试剂，以促进抗体渗透到细胞核(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。

c.膜蛋白被破坏：将缓冲液中的细胞破膜试剂减少或移除(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。

d.较厚的组织，如斑马鱼全胚胎或染色建议做细胞破膜，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合(应针对每种靶标调整最佳的破膜方法)。

关键步骤：

在每次的实验中，设置阳性与阴性对照组，以确认是该次实验的抗体、试剂、组织切片、实验过程的问题，还是目标蛋白本身表达量低的问题。

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